Le brouillard d'une pandémie et le «problème de réalité complexe» : les tests PCR, un passage du qualitatif au quantitatif indispensable

Tout au long de l'été, les cas de "tests positifs" ont augmenté, mais les admissions et les décès ont continué de baisser. Actuellement, on note un « frémissement », sommes toute fort raisonnable. Cependant, l'annonce d’un certain nombre de nouveaux « positifs » continue de susciter la crainte du public, et d’impacter les décisions de politiques publiques, notamment sur l'obligation de porter des masques en espaces extérieurs, sur laquelle un débat virulent est en cours. Et si les cas positifs ne reflétaient pas la situation réelle de la pandémie?

Source : https://www.gouvernement.fr/info-coronavirus/carte-et-donnees, le 5 septembre 2020

Nous allons apporter un éclairage au travers de cet article en trois parties :

• Les tests positifs de coronavirus augmentent mais les décès restent stables : Plusieurs explications peuvent être proposées.
• Une explication possible est ce que j'appelle le « problème de la réalité complexe » : les tests PCR sont beaucoup trop sensibles, et pas assez spécifiques.
• La solution n'est pas de tester moins, mais de tester mieux.

Partie 1 : les tests positifs de coronavirus augmentent mais les décès restent stables : Plusieurs explications peuvent être proposées.

Quelque chose d'assez étrange se passe dans plusieurs pays européens, ainsi qu’en France : Le Royaume-Uni, l'Italie, l’Espagne, etc. ont un nombre croissant de cas, mais un nombre stable et très faible de décès, même des semaines après que les cas ont recommencé à augmenter. Le ratio cas / décès est loin d'être ce qu'il était au plus fort de la pandémie. L'autre caractéristique notable est le déplacement des cas vers une population plus jeune.

Premièrement, l'agent viral peut avoir muté en une forme moins virulente. Bien qu'il existe des études publiées montrant des mutations mineures, c'est ce que vous attendez d'un virus à ARN qui est intrinsèquement instable (pensez aux virus de la grippe, qui changent perpétuellement de costume). Trois publications sont en faveur d'une mutation de la protéine spike par laquelle le virus s'attache aux cellules humaines, appelée mutation « D614G », rendant le virus plus contagieux mais moins dangereux, selon Paul Tambyah consultant senior à l'Université nationale de Singapour et président élu de la Société internationale des maladies infectieuses, et Sebastian Maurer-Stroh , de l'agence singapourienne pour la science, la technologie et la recherche. Ci-après l'étude la plus synthétique (Annexe 1).

Deuxièmement, une immunité préexistante dans une partie de la population a déjà été évoquée (Pre-existing immunity to SARS-CoV-2: the knowns and unknowns). Il peut y avoir un rôle protecteur des lymphocytes T mémoires dans l’immunité à long terme : Un bel article paru dans "Cell " indique que chez toute personne atteinte du Covid-19 (même celles présentant des cas bénins ou asymptomatiques) e SRAS-CoV-2 provoque des réponses cellulaires T mémoire robustes, larges et hautement fonctionnelles, ce qui suggère qu'une exposition naturelle ou une infection peut empêcher des épisodes récurrents de COVID-19 sévère (Annexe 2 COVID-19 Study Group, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19).

Une autre étude va dans le même sens (SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls.).

Troisièmement, nous nous sommes peut-être améliorés dans notre gestion de la Covid-19, Mais :

Hormis la dexaméthasone dans la petite population admise dans les unités de soins intensifs, il n'y a pas de traitement spécifique pour la maladie, sauf l’hydroxychloroquine, mais la controverse virulente autour de son efficacité décourage l’intuition que son utilisation puisse être responsable de la baisse actuelle des nouveaux cas…

Et comme nous n'observons pas d'augmentation substantielle des admissions ou de la gravité de la maladie, le rôle de l’utilisation seule de la dexaméthasone semble également une explication peu probable.

Quatrièmement, nos mesures préventives peuvent avoir fonctionné, n'autorisant de nouveaux cas que lorsque des manquements se sont produits.

Si tel était le cas, on s'attendrait à une efficacité contre toutes les formes d'infections respiratoires aiguës, comme les maladies hivernales. Cela s'est effectivement produit dans l'hémisphère sud, mais le changement d'âge ne correspond pas à cette théorie.

Partie 2 : une explication possible est ce que j’appelle le « problème de la réalité complexe » : les tests PCR sont beaucoup trop sensibles, et pas assez spécifiques.

Il y a de plus en plus de preuves que les tests utilisés dans le monde entier pour identifier les cas en mode binaire « Oui ou Non » sont utilisés de manière simpliste et non coordonnée.

Tom Jefferson et Carl Heneghan entre autres ont déjà expliqué les limites de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour réaliser des tests de masse (voir les quatorze études évoquées dans la revue suivante : Viral cultures for COVID-19 infectivity assessment. Systematic review).

Des preuves italiennes non publiées suggèrent que moins de 3% des personnes testées positives sont « infectieuses ». Les quatorze autres études sur la relation entre l'infectiosité et les résultats de la PCR citées ci-dessus vont dans le même sens. Ces études ont fourni des données limitées de qualité variable selon lesquelles les résultats de la PCR en soi sont peu susceptibles de prédire la culture virale à partir d'échantillons humains. Une attention insuffisante peut avoir été accordée à la relation entre les résultats de la PCR et la maladie. La relation avec l'infectiosité n'est pas claire et plus de données sont nécessaires à ce sujet. Si cela n'est pas compris, les résultats de la PCR peuvent conduire à des restrictions pour de grands groupes de personnes ne présentant pas de risque d'infection.

Ce problème de détection est omniprésent pour la détection des virus à ARN : L'ARN viral du SRAS-CoV, du MERS, de la grippe Ebola et du virus Zika peut être détecté longtemps après la disparition du virus infectieux (Annexe 3).

Alors qu'un stade infectieux peut durer environ une semaine, parce que l'ARN inactivé se dégrade lentement avec le temps, il peut encore être détecté plusieurs semaines après la dissipation de l'infectiosité.

Il est de plus en plus évident qu'une bonne proportion des `` nouveaux '' cas bénins et des personnes testées à nouveau positives après la quarantaine ou la sortie de l'hôpital ne sont pas infectées, mais éliminent simplement les particules virales inoffensives que leur système immunitaire a efficacement traitées (Annexe 4).

Ceux dont l'immunité est la plus active appartiennent exactement à la tranche d'âge des «positifs» observés et sont les moins susceptibles de développer une forme grave de la maladie.

La détection par PCR des virus est utile tant que ses limites sont comprises : bien qu'il détecte l'ARN en quantités infimes, il faut faire preuve de prudence dans les résultats car il ne détecte souvent pas de virus infectieux.

Limiter le nombre de Ct.

Pourquoi le seuil de cycle, ou Ct, est-il important ?

La RT-PCR utilise une enzyme appelée transcriptase inverse pour transformer un morceau spécifique d'ARN en un morceau d'ADN correspondant. La PCR amplifie ensuite l'ADN de manière exponentielle, en doublant le nombre de molécules à maintes reprises. Un signal fluorescent peut être attaché aux copies de l'ADN, et un test est considéré comme positif lorsque le signal fluorescent est suffisamment amplifié pour être détectable. Le seuil de cycle (appelé valeur Ct) est le nombre de cycles d'amplification nécessaires pour que le signal fluorescent franchisse un certain seuil. Cela permet d'amplifier et de détecter de très petits échantillons d'ARN. Plus le seuil de cycle est bas, plus la quantité d'ARN (matériel génétique) est élevée dans l'échantillon. Plus le nombre de cycles est élevé, moins il y a d'ARN dans l'échantillon.

La PCR est un test très sensible, ce qui signifie qu'il détecte les plus petits fragments du virus qu'il recherche en amplifiant l'échantillon des millions de fois. Cependant, un fragment n'est pas un virus entier, capable de se répliquer et d'infecter d'autres êtres humains. C'est une petite partie de la structure virale que recherche l'amorce de PCR, pas le micro-organisme dans son ensemble. Seuls des virus entiers peuvent nous infecter.

De plus, le nombre de cycles d'amplification nécessaires pour atteindre un «test positif » est rarement rapporté. Nous savons maintenant que celle-ci est une information vitale dans l'interprétation des résultats : Un nombre très élevé de cycles peut détecter des fragments et donner un résultat positif, mais un nombre inférieur de cycles est beaucoup plus susceptible d'identifier les individus infectés et infectieux nécessitant une quarantaine.

Ce nombre de cycles d'amplification nécessaires pour trouver le virus, appelé seuil de cycle, n'est jamais inclus dans les résultats envoyés aux médecins et aux patients atteints de coronavirus, même s'il pourrait leur dire à quel point les individus sont infectieux.

Enfin, un test très sensible est vulnérable à la contamination par du matériel génétique étranger (d'où la nécessité d'habiller les opérateurs). L'expansion rapide de la capacité de test peut avoir dégradé notre capacité de stérilité en augmentant le débit et en sollicitant la formation du personnel de laboratoire.

Les études actuelles examinant les différentes performances des kits PCR sur le même échantillon et les résultats ne sont pas encourageantes, avec une grande variation des seuils de cycle pour les mêmes résultats positifs indiquant l'exigence absolue de tests standardisés au niveau mondial permettant de comparer en permanence les procédures et les performances des tests par rapport au seul véritable étalon-or pour évaluer la contagiosité d'une personne : la culture virale.

Dans trois ensembles de données de test qui incluent des seuils de cycle, compilés par des responsables du Massachusetts, de New York et du Nevada, jusqu'à 90% des personnes testées positives ne portaient pratiquement aucun virus, selon un article paru le 29 août dans le New York Times : Les fonctionnaires du Wadsworth Center, le laboratoire d’État de New York, ont fourni les valeurs de Ct des tests réalisés au New York Times : En juillet, le laboratoire a identifié 794 tests positifs, sur la base d'un seuil de 40 cycles. Avec un seuil de 35, environ la moitié de ces tests ne seraient plus considérés comme positifs. Environ 70% ne seraient plus jugés positifs si les cycles étaient limités à 30. Dans le Massachusetts, de 85 à 90% des personnes testées positives en juillet avec un seuil de cycle de 40 auraient été jugées négatives si le seuil était de 30 cycles.

Une solution serait d'ajuster et de standardiser le seuil de cycle utilisé maintenant pour décider qu'un patient est infecté. La plupart des tests fixent la limite à 40, quelques-uns à 37. Cela signifie que vous êtes positif pour le coronavirus si le processus de test a nécessité jusqu'à 40 cycles, ou 37, pour détecter le virus. Des tests avec des seuils si élevés peuvent détecter non seulement des virus vivants, mais aussi des fragments génétiques, des restes d'infection qui ne présentent aucun risque particulier (un peu comme trouver un cheveu dans une pièce longtemps après le départ d'une personne). Tout test avec un seuil de cycle supérieur à 35 est trop sensible, un seuil plus raisonnable serait de 30 à 35, ce qui reste à déterminer. Ces changements signifieraient que la quantité de matériel génétique dans l’échantillon d’un patient devrait être de 100 à 1 000 fois supérieure à la norme actuelle pour que le test renvoie un résultat positif. Les propres calculs du C.D.C. suggèrent qu’il est extrêmement difficile de détecter un virus vivant dans un échantillon au-dessus d’un seuil de 33 cycles. Les responsables de certains laboratoires d'État ont déclaré que le C.D.C. ne leur avait pas demandé de noter les valeurs seuils ou de les partager avec les organisations de recherche de contacts.

Cela représente une énorme opportunité manquée d'en savoir plus sur la maladie, et encore une fois les données qui devraient permettre de prendre les décisions de politique publique sont laissées à la libre appréciation des industriels. Actuellement les plages de seuils de cycle ne sont pas standardisés, et laissé à la libre appréciation des fabricants commerciaux et des laboratoires. Les CDC ont déclaré qu'ils examinaient l'utilisation de mesures de seuil de cycle « pour les décisions politiques ». Quid de la France et de l’Europe ?

Etalonner les tests de RT-PCR par la culture virale ?

Tom Jefferson et Carl Heneghan ont examiné dans une revue systématique les données concernant le lien entre PCR et la culture virale, afin de mieux comprendre comment les résultats de PCR reflètent l’infectiosité ( Viral cultures for COVD-19 infectivity assessment. Systematic review. Tom Jefferson, Elisabeth Spencer, John Brassey, Carl Heneghan. medRxiv 2020.08.04.20167932;).

La culture virale est considérée comme un étalon-or ou un test de référence par rapport auquel tout test d'index de diagnostic pour les virus doit être mesuré et calibré, pour comprendre les propriétés prédictives de ce test. En culture virale, des virus sont injectés dans les lignées cellulaires du laboratoire pour voir s'ils causent des dommages cellulaires et la mort, libérant ainsi tout un ensemble de nouveaux virus qui peuvent continuer à infecter d'autres cellules.

Malheureusement, ces études ont fourni des données limitées de qualité variable selon lesquelles les résultats de la PCR en soi sont peu susceptibles de prédire la culture virale à partir d'échantillons humains. Une attention insuffisante peut avoir été accordée à la relation entre les résultats de la PCR et la maladie. La relation avec l'infectiosité n'est pas claire et davantage de données sont nécessaires à ce sujet.

Les résultats indiquent que des seuils de charge d'ARN viral doivent être utilisés : pour comprendre qui est infectieux, l'étendue de toute épidémie et pour contrôler la transmission.

Il est indispensable de pouvoir déterminer des seuils de charge d’ARN viral indiquant clairement à partir de combien de virus la maladie se déclenche, et devient transmissible.

Partie 3 : la solution n’est pas de tester moins, mais de tester mieux.

Toute mesure prise actuellement pour réduire les niveaux de tests en modifiant les directives est un pas dans la mauvaise direction : Il est indispensable de pouvoir différencier les personnes asymptomatiques non contagieuses des personnes pré-symptomatiques potentiellement contagieuses et nécessitant une prise en charge médicale.

Le FDA (Federal Drug Administration) a noté que les personnes peuvent avoir une faible charge virale lorsqu'elles sont nouvellement infectées. Un test moins sensible manquerait ces infections. Mais ce problème peut être facilement résolu : Tester les individus six heures plus tard ou 15 heures plus tard ou autre, un test rapide permettrait de trouver ces patients rapidement, même s'il était moins sensible, car leur charge virale augmenterait rapidement. Mais aux taux de test actuels, nous ne pouvons pas refaire les tests assez souvent pour avoir une chance de vraiment capturer quelqu'un dans cette fenêtre.

De plus, moins d'un an après le début de cette pandémie, nous ne connaissons toujours pas toute l'ampleur des conséquences à long terme de la contraction du coronavirus, même si la rencontre initiale semble bénigne. Les cas rapportés de personnes souffrant de séquelles, ou développant des formes de la maladie chroniques deviennent de plus en plus fréquents, et nous auront à nous en préoccuper dans l’avenir.

De nouvelles données soulignent la nécessité d'une utilisation plus généralisée des tests rapides, même s'ils sont moins sensibles. Une polémique a actuellement cours aux USA, suite à la modification récente des directives concernant la politique de test : Les « Centers for Disease Control and Prevention » (CDC) ont discrètement modifié leurs directives de test des coronavirus le 24 août, afin d’exclure les personnes qui ne présentent pas de symptômes de Covid-19 (même si elles ont été récemment exposées au virus). Les experts ont remis en question la révision, soulignant l'importance d'identifier les infections dans la petite fenêtre immédiatement avant l'apparition des symptômes, lorsque de nombreuses personnes semblent être les plus contagieuses.

Alors qu'est-ce qui est donné à voir ici ? Les laboratoires devraient-ils ajuster leurs protocoles pour qu'ils soient légèrement moins sensibles, exécutant un peu moins de cycles de PCR pour éviter de balayer les personnes avec des charges virales infinitésimales avec le reste des personnes infectées ? Certains experts affirment que ce n’est pas si simple. Le problème de base est que si le seuil de cycle d'un échantillon (ou CT, le terme technique pour le nombre de cycles exécutés avant d'atteindre paydirt) peut approximativement approximer la saturation virale d'un échantillon, cela ne correspond pas nécessairement à la charge virale de la personne testée. Ou pour le dire autrement : simplement parce qu’un écouvillon ne ramasse qu’une petite quantité de virus de vos sinus, cela ne signifie pas que le bogue n’est pas vivant et ne frappe pas le reste de votre corps.

Conclusion

Ainsi, nous avons d’une part la réalité de la circulation virale, probablement en déclin rapide et d’autre part la réalité perçue d'un test performant mal utilisé et interprété malheureusement de façon binaire, qui peut être utilisé avec beaucoup d'efficacité lorsque la circulation virale est beaucoup plus élevée, mais dont l’interprétation actuelle est sujette à caution.

• Pour appréhender de façon sensée cette double réalité et afin d’éviter les dérives éventuelles dans la prise de décision des isolements individuels, ainsi que de re-confinements éventuels qu’ils soient localisés ou généralisés, avec les dangers économiques et sociétaux d'isoler des personnes non infectieuses ou des communautés entières, nous avons besoin d'un effort international pour normaliser les tests, l'étalonnage périodique par rapport à la culture virale, ou d'autres mesures reconnues efficaces en détection de l'infectiosité, et des protocoles et procédures de laboratoire stricts.
• La médecine et la santé publique doivent se préoccuper des personnes, et pas de résultats biologiques pris en compte de façon « brute » et isolée. Il s’agit alors de développer une évaluation quantitative, la réponse binaire « positif-négatif » ne suffisant plus.
• La détermination d’un Ct « normalisé » semble actuellement indispensable.
• Une des solutions alternatives et complémentaire pourra être l'utilisation encore plus répandue de tests rapides (différents des tests de RT-PCR actuellement utilisés en grande majorité) avec un seuil ajusté pour cibler les personnes les plus infectieuses atteintes de COVID-19. Ces tests rapides pourront être standardisés en fonction d’un nombre de Ct défini, permettant d’augmenter la spécificité de ce test actuellement probablement « trop sensible ». Ils devront être rapides, bon marché et suffisamment abondants pour tester fréquemment ceux qui en auront besoin, même s’ils sont moins sensibles. Cela permettrait de diagnostiquer les personnes les plus contagieuses, y compris les super-propagateurs.
• La méconnaissance des Ct des tests réalisés actuellement représente une énorme opportunité manquée d'en savoir plus sur la maladie, et encore une fois les données qui devraient permettre de prendre les décisions de politique publique sont laissées à la libre appréciation des industriels : Les plages de seuils de cycle ne sont pas standardisées, et laissées à la libre appréciation des fabricants commerciaux et des laboratoires. Les CDC ont déclaré qu'ils examinaient l'utilisation de mesures de seuil de cycle « pour les décisions politiques ». Quid de la France et de l’Europe ?
• Ces données et normes sont des connaissances fournies par des activités scientifiques mobilisées pour appuyer, développer ou adapter les décisions en matière de politique publique, et relève de la Science de Régulation ® (Annexe 5). Quasi inexistante en Europe, mais professionnalisée aux USA et au Japon, il semble urgent de développer et démocratiser cette science au sein de l’Europe, et de la France.

Annexe 1 : Nathan D. Grubaugh, William P. Hanage, Angela L. Rasmussen.Making Sense of Mutation: What D614G Means for the COVID-19 Pandemic Remains Unclear. Cell, Volume 182, Issue 4, 20 August 2020, Pages 794-795.

Annexe 2 : COVID-19 Study Group, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19 Sekine, T., Perez-Potti, A., Rivera-Ballesteros, O., Strålin, K., Gorin, J.-B., Olsson, A., Llewellyn-Lacey, S., Kamal, H., Bogdanovic, G., Muschiol, S., Wullimann, D.J., Kammann, T., Emgård, J., Parrot, T., Folkesson, E., Rooyackers, O., Eriksson, L.I., Henter, J.-I., Sönnerborg, A., Allander, T., Albert, J., Nielsen, M., Klingström, J., Gredmark-Russ, S., Björkström, N.K., Sandberg, J.K., Price, D.A., Ljunggren, H.-G., Aleman, S., Buggert, M., Karolinska, Cell (2020).

SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls. Le Bert, N., Tan, A.T., Kunasegaran, K. et al.  Nature 584, 457–462 (2020).

Annexe 3 : Peiris JS, Chu CM, Cheng VC, et al. Clinical progression and viral load in a community outbreak of coronavirus-associated SARS pneumonia: a prospective study. Lancet 2003; 361: 1767–72); (Chan KH, Poon LL, Cheng VC, et al. Detection of SARS coronavirus in patients with suspected SARS. Emerg Infect Dis 2004; 10: 294–99); (Oh MD, Park WB, Choe PG, et al. Viral load kinetics of MERS coronavirus infection. N Engl J Med 2016; 375: 1303–05) ; (Wang Y, Guo Q, Yan Z, et al. Factors associated with prolonged viral shedding in patients with avian influenza A(H7N9) virus infection. J Infect Dis 2018; 217: 1708–17); (Sissoko D, Duraffour S, Kerber R, et al. Persistence and clearance of Ebola virus RNA from seminal fluid of Ebola virus disease survivors: a longitudinal analysis and modelling study. Lancet Glob Health 2017; 5: e80–88);(Paz-Bailey G, Rosenberg ES, Doyle K, et al. Persistence of Zika virus in body fluids— final report. N Engl J Med 2017; 379: 1234–43)

Annexe 4 : Lu J, Peng J, Xiong Q, et al. Clinical, immunological and virological characterization of COVID-19 patients that test re-positive for SARS-CoV-2 by RT-PCR [published online ahead of print, 2020 Aug 24]. EBioMedicine. 2020;59:102960. doi:10.1016/j.ebiom.2020.102960.

Annexe 5 : Science Règlementaire. Olivier Borraz et David Demortain in Emmanuel Henry et al., Dictionnaire critique de l’expertise Presses de Sciences Po | « Références »2015 | pages 279 à 285)